12 13 Держите руку на пульсе Точ ное и повторяемое п и пет и рова н ие с лож н ы х ж и д костей Пипетирование кажется легким, но некоторые советы и рекомендации могут помочь вам достичь постоянных и воспроизводимых результатов – даже при пипетировании сложных жидкостей. Восп роизвод и ма я а м п л ифи ка ц и я Д НК в ПЦ Р Хоть выполнение ПЦР на сегодняшний день и является легкой и хорошо отлаженной процедурой – но вы все еще можете столкнуться с некоторыми проблемами. Убедитесь, что выполнение ПЦР пройдет наилучшим образом, вос- пользовавшись несколькими простыми ноу-хау. вытеснения Первый упор Дозатор, работающий по принципу воздушного Диспенсер, работаю- щий по принципу пози- тивного вытеснения Второй упор Rest position слишком оптимально слишком Мастер-микс Хорошая воспроизводимость Плохая воспроизводимость 2 Прямое и обратное пипетирование Прямой забор жидкости: 1. Нажмите до первого упора 2. Полностью переместитесь вверх Сброс жидкости: Нажмите вниз через первый упор до второго низко высоко 1 Измерение концентрации ДНК Определите концентрацию и чистоту вашей пробы ДНК. Идеальный диапазон чистоты ДНК (A 260   /A 280 ) = ~1,7 – 2,0 2 Подготовка мастер-микса Во избежание различий при пипетировании, которые мо- гут возникнуть из-за подготовки нескольких мастер-мик- сов, подготавливайте мастер-микс только в одной пробир- 1 > Погрузите наконечник в жидкость на минимальное расстояние, чтобы предотвратить перенос жидкости на внешнюю сторону наконечника > Погрузите наконечник достаточно Обратный забор жидкости: 1. Нажмите до второго упора 2. Полностью переместитесь вверх Сброс жидкости: Нажмите до первого упора Обратите внимание на показание абсорбции (не равно значениям концентрации). Оно должно находить- ся между 0,1 – 1,0 A для надежного считывания показаний в соответствии с законом Бугера – Ламберта – Бера. ке. Используйте достаточно большую пробирку (напр., 5 мл), чтобы надежно вместить весь объем мастер-микса. После этого незамедлительно выполняйте аликвотирова- ние, чтобы избежать размораживания, что может негатив- но сказаться на вопроизводимости вашей ПЦР. Mg глубоко, чтобы избежать втягивания воздуха Объем в мкл Глубина в мм 0,1 – 1 1 1 – 100 2 – 3 100  – 1 000 2 – 4 1 000 –10 000 3 – 6 0° 3 Очень холодные жидкости сокращают объем воздуха в воздушной подушке дозатора. Следовательно, при частом использовании очень холодных или очень горячих жидкостей следу- ет соответствующим обра- зом выполнить калибровку дозатора. Нелегко точно пипетиро- вать пробы жидкостей с повышенным пенообразова- нием, особенно если перед этим они были перемешаны. При использовании дозато- ра, работающего по принци- пу воздушного вытеснения, для уменьшения этого эф- фекта рекомендуется метод обратного пипетирования. Однако при использовании диспенсера, работающего по принципу позитивного вытеснения, можно полно- стью держать этот эффект под контролем. Вязкие жидкости имеют повышенное сопротивле- ние при заборе в наконеч- ник для дозатора и при дозировании. При использовании дозатора, работающего по принципу воздушного вытеснения, рекомендует- ся медленное пипетирова- ние и применение метода обратного пипетирования. Однако чтобы полностью избежать данную пробле- му, идеальным решением будет диспенсер, работаю- щий по принципу позитив- ного вытеснения. 3 В случае неспецифических амплификаций Используйте протоколы с горячим стартом. Убедитесь, что ваш амплификатор откалиброван надлежащим образом и быстро достигает заданной температуры во время цикла. При использовании новых праймеров выполните опти- мизацию цикла с одним праймером (т.е. только прямое или обратное пипетирование праймера) для определе- ния неспецифичности 12 Titrate Mg 2+ и для оптимизации концентрации вашей реакции ПЦР. MAGNESIUM 24.305 4 В случае низкой амплификации или ее отсутствия Оптимизируйте денатурирование и/или температуру отжига с градиентом Используйте усилители реакции ПЦР (напр., ДМСО, БСА и т.д.), для каждого необходимо провести эмпирические исследования для определения специфических сочетаний основы и праймера 4 При аспирации дозатор должен находиться в наиболее вертикальной позиции. Следует избегать заметного наклона. Наклон дозатора при пипетировании также должен быть одинаковым. температура слишком высокая температура слишком низкая stayinformed